Her bir canlı, sayısız molekülden meydana gelir. Canlılardaki moleküllerin çok önemli bir kısmını ise proteinler oluşturur. Proteinler bir araya gelerek, hareket ederek ve birbirleriyle iletişim kurarak yaşamı mümkün kılan minik hücresel makinelerdir. Peki çıplak gözle görmenin imkansız olduğu bu proteinlerin neye benzediğini, nasıl çalıştıklarını nereden biliyoruz? Bu yazımızda sizlerle, proteinlerin yapısını çözümlemede kullanılan önemli bir tekniği inceleyeceğiz.
Cryo-EM (Cryogenic Electron Microscopy) bilim dünyasında kullanım alanı gün geçtikçe artan bir görüntüleme tekniğidir. Bu teknikte görüntülenecek örnekler kriyojenik (çok soğuk) sıcaklıklara kadar soğutulup elektron mikroskobuyla görüntülendiği için bu isim verilmiştir. Bu tekniği geliştirdikleri için 2017 Nobel Kimya ödülü Jacques Dubochet, Joachim Frank ve Richard Henderson’a verilmiştir.
2013 öncesi (sol) ve günümüz (sağ) çözünürlük farkı
Proteinler suda çözünmüş halde bulunan makromoleküllerdir. Sıvı basıncı ve su moleküllerinin proteinler ile kurduğu zayıf fiziksel bağlar, proteinlere hücre içindeki şeklini verir. Bu sebeple proteinlerin neye benzediğini anlamak için onları su içinde gözlemlemeliyiz. Tam bu noktada bir sorun ortaya çıkar: proteinler sıvı suyun içinde rastgele hareketlerle dolaşır. Bu yüzden protein çözeltisi sıvı haldeyken onları sabit tutup görüntülerini yakalamak imkansızdır. Görüntüleme yapmak için bu çözeltiyi dondurarak molekülleri sabitlemek gerekir.
Moleküller normal bir hızda dondurulurken başka bir problemle karşılaşırız. Çözeltiler soğudukça ısının yarattığı hareketlilik azalır ve moleküller arası bağların etkisi artar. Bu elektriksel bağların etkisiyle moleküller kutuplanmış bir şekilde dizilirler ve öteleme hareketini azaltırlar. Giderek daha düzenli bir forma ulaşırlar. Moleküllerin düzenli bir şekilde sıralandığı bu sürece kristalleşme denir. Protein içeren bir çözeltiyi normal bir hızda soğuttuğumuz zaman proteinin etrafındaki su molekülleri kristalleşirler. Bu buz kristalleri, proteinleri görüntülemek için yollayacağımız elektron demetini kırınıma uğratarak proteinin doğru yapısını görmemize engel olur. Cryo-EM bu sorunu hızlı soğutma yöntemiyle aşar. Protein çözeltisi ince bir tabaka şekline getirilir ve sıvı etan gibi bir kriyojene daldırılıp hızla soğutulur. Bu şekilde su molekülleri kristalleşmeye zaman bulamadan çözelti donar.
Hızlı soğutma işlemi
Dondurulan çözelti, elektron mikroskobuna yerleştirilmeye hazır olduktan sonra elektron mikroskobu, örneğin üzerine bir elektron demeti yollayıp dedektörde bir görüntü oluşmasını sağlayacaktır. Başka bir problem de burada karşımıza çıkar: elektronlar örneğimizdeki protein moleküllerine zarar verebilir ve yapısını bozabilir. Cryo-EM teknolojisi, elektron radyasyonunu çok fazla sayıdaki proteinin üzerine ateşler. Böylece protein başına düşen radyasyon protein yapısına zarar vermeyecek kadar az olur.
3 mikrolitre örnek
Elektron mikroskobu
Elektron mikroskobunda yakalanan protein görüntüleri
Görüntü oluşturmak için elektronlar donmuş çözeltinin içerisinden geçirilir ve dedektöre ulaşır. Proteindeki atomların diziliminden dolayı, dedektörde çok sayıda eşsiz ‘gölge’ içeren iki boyutlu bir görüntü oluşur. Bu görüntüde proteinler hangi pozisyonda donmuşlarsa o yönden gözükürler, yani hiçbir gölge birbirinin aynısı değildir. Her bir proteinin gölgesi oldukça bulanık ve düşük çözünürlüktedir. Bu haliyle proteinlerin üç boyutlu yapısını anlamak hala mümkün değildir.
Gölge görüntüleri
Bilgisayar teknolojisi bu aşamada işimizi kolaylaştırıyor. Bilgisayarlar aynı açılardan çekilmiş, düşük çözünürlükteki binlerce protein resmini birleştirip yüksek çözünürlüğe sahip görüntüler oluştururlar. Atomik seviyelerdeki ayrıntıları gösterebilen bu modeller iki boyutludur. İki boyutlu, farklı açılardan çekilmiş bu görüntüler ise bilgisayar yardımıyla bir araya getirilir ve sonunda proteinin üç boyutlu yapısı modellenmiş olur.
Farklı açı görüntüleri
Görüntü birleştirme sonucu protein görünümü
Cryo-EM tekniğiyle üretilen, en ince detayları gösterebilen modeller biyokimyada ve yapısal biyolojide bir devrim yarattı ancak görünen o ki, bu sadece başlangıç. Cryo-EM proteinlerin yapısından öte, onların nasıl hareket ettiğini ve nasıl işlediğini anlamamıza yardımcı olabilir. Bir protein çözeltisini, proteinler iş yaparken dondurursak, içinde olduğu eylemin farklı anlarında yakalanmış sayısız proteine sahip olmuş oluruz. Bu görüntüler, bir filmin karelerine benzer. Eğer tüm bu kareleri birleştirirsek bir proteinin çalışırken filmini çekebiliriz! Mesela bir enzimin işleyişinin veya moleküllerin etkileşiminin videolarını kaydedebiliriz.
Yaşam denen karmaşık ve gizemli bu oluşum, en küçük yapıtaşlarının, en küçük hareketleri sayesinde her saniye tıkır tıkır işliyor. Eğer canlılığın en temelindeki işleyişi daha iyi kavrayabilirsek, yaşamı anlamaya bir adım daha yaklaşabiliriz.
Yazar:Muzaffer Elbeyli
Editör: Cengizhan Öztürk
Referanslar:
Bai, X. C., McMullan, G., & Scheres, S. H. (2015). How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in biochemical sciences, 40(1), 49-57.
Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., & Walz, T. (2015). A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell, 161(3), 438–449. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.03.050
Mirsky,S.(Host).(2017,October 4).Nobel Prize Explainer: Catching Proteins in the Act.In Science Talk.Scientific American.https://www.scientificamerican.com/podcast/episode/nobel-prize-explainer-catching-proteins-in-the-act/
The 2017 Nobel Prize in Chemistry: Cryo-electron microscopy explained. (2017, October 5). [Video]. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=026rzTXb1zw
Cryo-electron Microscopy at the University of Michigan. (2017, December 8). [Video]. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=m8QNXbW1ySI
A 3 minute introduction to CryoEM. (2011, August 18). [Video]. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=BJKkC0W-6Qk
Cryo-EM Animation. (2018, May 30). [Video]. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=6G550DfY75Q
Comments